Le Cénacle, avec sa célèbre fresque d'Andrea del Sarto, abrite depuis 1817 une collection d'œuvres d'art provenant des églises et monastères supprimés de la ville de Florence et des collections saisies par l'Académie. La grande fresque représentant la Dernière Cène, sur le mur du fond du réfectoire, fut commandée par l'abbé Ilario Panichi à Andrea del Sarto en 1511 et terminée en 1527. Andrea del Sarto, inspiré par la célèbre Cène de Léonard de Vinci à Milan, reprend les apôtres lorsqu'ils reçoivent l'annonce de la trahison de Jésus et ajoute dans la partie supérieure une petite scène originale de deux personnages face à une terrasse qui assiste à l'événement. Tout au long du parcours du musée, aménagé dans les salles du couvent (le couloir, la cuisine, la salle du lavabo, le réfectoire) des peintures du XVIe siècle sont exposées qui témoignent avec d'excellents exemples de la peinture florentine de l'époque. Parmi ces peintures, des œuvres de Pontormo (en particulier Foi et Charité, de l'autre côté du réfectoire, au-dessus de l'entrée), Franciabigio, Raffaellino del Garbo, Bachiacca, Carlo Portelli, Bernardino Poccetti et un ensemble de peintures de Plautilla Nelli (1524-1588), une des rares artistes mentionnées par Giorgio Vasari dans « Vite » et connue aujourd'hui comme la « première femme peintre de Florence ».