Ses collections de peintures contiennent des chefs-d'œuvre absolus de l'art de tous les temps, en particulier du XIVe siècle et de la Renaissance : Giotto, Simone Martini, Piero della Francesca, Beato Angelico, Filippo Lippi, Botticelli, Mantegna, Correggio, Léonard de Vinci Raphaël, Michel-Ange, Caravage, Canaletto. Les collections de peintres allemands, néerlandais et flamands, dont Dürer, Rembrandt, Rubens, Goya, sont également importantes. Non moins importante dans le panorama de l'art italien est la collection de statues et bustes de l'antiquité de la famille Médicis. La collection embellit les couloirs de la Galerie et comprend d'anciennes sculptures romaines, copies d'originaux grecs perdus. La Galerie est située au premier et au deuxième étage du grand bâtiment construit entre 1560 et 1580 sur un projet de Giorgio Vasari comme siège des principaux bureaux administratifs de l'État toscan. Aujourd'hui, le Musée abrite également le célèbre Cabinet des Dessins et Estampes.