Il museo ha sede nell’antico Cenacolo del convento eretto a fianco della chiesa di Santo Spirito dai frati eremitani di Sant’Agostino. Edificato in stile gotico nel XIV secolo, è l’unico ambiente dell’insigne complesso monumentale di Santo Spirito che conserva la struttura originaria. La sua antica funzione è ricordata dall’imponente affresco trecentesco di Andrea Orcagna e aiuti che ne decora tutta la parete orientale, con in basso frammenti di un’Ultima Cena e in alto una superba Crocifissione. L’affresco è non solo una delle opere migliori dell’Orcagna, ma anche una delle più vaste pitture murali del Trecento giunte fino a noi. Il museo ospita le opere donate al Comune di Firenze nel 1946 dal collezionista e antiquario campano Salvatore Romano, una pregiata raccolta di sculture, frammenti di decorazione architettonica, affreschi staccati e arredi, di varia provenienza e di epoca compresa tra l’antica età romana e il XVII secolo. Come previsto dall’atto di donazione, la raccolta conserva ancora oggi il suggestivo allestimento, di gusto ornamentale ed evocativo, che fu realizzato sotto la direzione di Salvatore Romano.